【細胞生長曲線的測定實驗目的】
掌握繪制細胞生長曲線的原理和方法。
【細胞生長曲線的測定背景與原理】 生長曲線是測定細胞生長數的常用方法,也是判定細胞活力的重要指標,是培養細胞生物學特性的基本參數之一。一般細胞傳代之后,經過短暫的懸浮后貼壁,隨后渡過長短不同的潛伏期,即進入快速生長的指數生長期。在細胞達到飽和密度后,停止生長,進入平臺期,然后退化衰亡。為了準確描述整個過程中細 胞數目的動態變化,需連續對細胞進行計數。通常計數6天。為精確起見,一般每次實驗設3個平行重復。
【材料、試劑與儀器】
1、實驗材料: Hela細胞系。
2、實驗試劑: DMEM培養基(青霉素,鏈霉素,10%血清),0.25%胰蛋白酶溶液,臺酚藍染液。
3、 實驗儀器: 超凈工作臺,CO2培養箱,倒置顯微鏡,微量移液器,血細胞計數板,培養瓶,離心管,移液管,廢液缸,蓋玻片,24孔板。
【方法與步驟】
1、取生長良好的細胞,用培養基制成細胞懸液后計數。根據細胞計數結果按5×104/mL作傳代培養接種于24孔板中,共接種21孔細胞。1ml/孔。余下三孔可設傳代培養的對照。
2、24h后每天記錄細胞數目,每次取3孔細胞,分別進行計數。計算平均值。連續計數7d。細胞用胰酶消化后加入一定量的培養基,混勻制成細胞懸液。取少量懸液與臺酚藍1:1混合。取一干凈的血細胞計數板, 蓋上蓋片,從蓋片兩邊滴入細胞懸液使之充滿計數板和蓋片之間。注意滴液勿有氣泡,也不能太多,否則會使蓋片浮起而使細胞計數不準。
3、低倍鏡下觀察,活細胞不著色,臺盼藍著色的細胞呈深藍色,是不健康或已死亡的細胞,不能計數。 找出計數板上的方格,計算四角大格內總細胞數,壓大格線者只計左側和上方,不計右側和下方細胞懸液中細胞密度計算公式為:細胞數/mL=(四角大格內細胞數/4)×104×2
4、根據細胞計數結果,以單位細胞數(細胞數/mL)為縱坐標,以時間為橫坐標繪制生長曲線。
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