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免疫熒光(石蠟-三標)

免疫熒光 

免疫熒光技術又稱為熒光抗體技術,將熒光標記技術和免疫學方法結合起來,利用抗原抗體相互作用從而對組織或細胞內的 抗原或抗體物質進行定位、示蹤、定性以及相對定量等。 

實驗意義 

1.免疫熒光技術特異性強、敏感性高、反應速度快、結果清晰明確,在臨床檢驗和科學研究工作上有很高的應用價值。 

2.操作簡便,便于推廣。 

實驗步驟 一、脫蠟至水 

1.石蠟切片56℃ 預熱3h。 

2.二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ 各5min脫蠟 

3.無水乙醇Ⅰ和無水乙醇Ⅱ復水2min。 

4.95%、90%、80%、70%的乙醇各2min。 

5.去離子水洗3min。 

6.1×PBS洗3min×2次。 二、抗原修復 

7.切片置0.01M PH6.0 檸檬酸鹽緩沖液中再放入高壓鍋,蓋上蓋子及高壓閥,待有蒸汽冒出開始計時加熱 15min。(或CB液中微波中高火5min煮沸,然后中火維持沸騰20min),將高壓鍋置流水下沖洗減壓,安 全打開高壓鍋。 7’. 將切片置于0.01mol/L且ph=6.0的枸櫞酸液修復液中,用微波爐中火加熱6分鐘至微微沸騰,再用中低火 力維持10分鐘,停止加熱后自然冷卻至室溫。(煮沸6分鐘×4次可能更好)。 

8.讓載片在原檸檬酸鹽緩沖液中自然冷卻至室溫,降至室溫前切勿取出。 

9. PBS浸洗2分鐘后滴加0.3%tritonX-100透膜劑透膜12分鐘(不透膜也沒關系,反正細胞早就被切開了)。但注意細胞膜表面的整合蛋白不能加tritonX-100,否則會被洗掉。

10.PBS洗3minX2次。

三、免疫標記

1. 甩干PBS,正常山羊血清在濕盒中37℃封閉30分鐘。 

2. 甩去山羊血清,勿洗,種屬來源不同的Ab1和Ab2按適當比例混合后滴加于切片樣品位置,濕盒中4℃ 過夜(或37℃ 2h)。注意設置對照.(對照可分為陰性對照、陽性對照和空白對照,根據實驗需要設 置)。 

3. 室溫復溫45min。 

4. PBS洗3min×5次。 

5. 甩去PBS,滴加相應的適當濃度的二抗(我這里使用FITC標記的二抗與Ab1結合,TRITC標記的二抗 與Ab2結合)。37℃濕盒中孵育1h。 

6. PBS洗5min×3次。

7. 滴加 Hoechst 33342(或DAPI)避光孵育2分鐘,可對標本進行顯核,藍色熒光,效果佳。

8. PBS洗2min×4次 

9. 封片劑封片,熒光顯微鏡觀察或顯微照相。 

注意: 

1.在實驗過程中勿使切片樣品變干,以免影響實驗效果。 

2.若一張切片同時做兩種抗體的免疫熒光,則加一抗時可將兩種一抗按各自所需的濃度混合,但要注意抗 體要來源于不同的動物。加二抗時也可將兩種二抗按各自所需的濃度混合,但要注意二抗要有不同的顏色。 

3. 第7步和第7'步任選一。

大鼠造血干細胞免疫熒光三標圖片(圖中核標為藍色,細胞質標記為紅色,細胞膜標記為綠色,紅綠共標記區為黃色,紅、 綠、藍共標記區為白色)。


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