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免疫熒光(冰凍-雙標)/免疫熒光(石蠟-雙標)

在同一組織細胞標本上需要同時檢測兩種抗原時,需進行雙重熒光染色。雙重免疫熒光標記法(double immunofluorescence labeling method)也分為直接法和間接法。 

標本要求:

切片、爬片 

冰凍切片熒光tunel+免疫熒光雙標實驗步驟 

1、冰凍切片固定:冰凍切片從冰箱拿出來復溫,晾干水分,冷B酮固定10min,待B酮完全干后于PBS(PH7.4)中在脫色 搖床上晃動洗滌3次,每次5min。 

2、修復:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止液體流走),在圈內滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲存液用 PBS 1:9稀釋)覆蓋組織,37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。 3、 破膜:切片稍甩干后在圈內滴加破膜工作液覆蓋組織,常溫下孵育20min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上 晃動洗滌3次,每次5min。 

3、加試劑1,2:按片子數量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合(試劑1,2為現配現 用),加到圈內覆蓋組織,切片平放于濕盒內,37℃恒溫孵育2小時,濕盒內加少量水保持濕度。 

4、BSA封閉:將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min,在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織,室 溫封閉30min。 

5、加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。(濕盒內加少 量水防止抗體蒸發) 

6、加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬 的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min。 

7、DAPI復染細胞核:切片用PBS(PH7.4)洗滌3次,每次5min。去除PBS后在圈內滴加DAPI染液,避光室溫孵育 10min。 

8、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。 

10、 鏡檢拍照:切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發波長330-380nm,發射波長420nm;FITC綠光 激發波長465-495nm,發射波長515-555 nm;CY3紅光激發波長510-560,發射波長590nm) 

石蠟切片熒光tunel+免疫熒光雙標實驗步驟

1、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯I15-20min-二甲苯II15-20min-無水乙醇I10min-無水乙醇II10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗(冬天脫蠟時間稍微延長)。

2、 修復:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止液體流走),在圈內滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲存液用 PBS 1:9稀釋)覆蓋  組織,37度溫箱解育30min,將玻片置干PBS(PH7.4)中在脫色搖床上異動洗滌3次,每次5min

3、破膜:切片稍甩干后在圓內滴加破膜工作液要蓋組織,常溫下孵育20min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min

4. 加試劑1.2:按片子數量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑1(TdT)和試劑2(dUTP)按2:29混合,加到圈內要蓋組織。切片平放干混盒內,37°C恒濕箱解音2小時,混盒內加少墨水保持溫度。

5、 BSA封閉:將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min,在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織,室 溫封閉30min

6、 加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。(濕盒內加少 量水防止抗體蒸發) 

7、 加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬 的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min。 

8、 DAPI復染細胞核:切片用PBS(PH7.4)洗滌3次,每次5min。去除PBS后在圈內滴加DAPI染液,避光室溫孵育 10min。 

9、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。 10、 鏡檢拍照:切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發波長330-380nm,發射波長420nm;FITC綠光 激發波長465-495nm,發射波長515-555 nm;CY3紅光激發波長510-560,發射波長590nm) 

注意事項 

1、熒光染色后一般在1h內完成觀察,或于4℃保存4h,時間過長,可能會使熒光提前衰退。 

2、每次試驗均需設置以下三種對照: 

(1)陽性對照:陽性血清+熒光標記物; 

(2)陰性對照:陰性血清+熒光標記物; 

(3)熒光標記物對照:PBS+熒光標記物。

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